Obtenção de metabólitos secundários: Purificação e Identificação

Após a extração do meio de cultura com acetato de etila, o resíduo poderá ser fracionado, purificado e identificado através dos seguintes métodos:

1. Cromatografia de camada delgada

A cromatografia de camada delgada (CCD) é uma técnica rápida, barata e simples e das mais utilizadas rotineiramente. Sua desvantagem é a baixa precisão na quantificação (relativamente em comparação à HPLC e CG.) e a falta de automação As placas de vidro (5 placas de 20 X 20 cm) são colocadas em superfície plana, limpas com éter de petróleo ou hexano embebido em algodão. Pesa-se 25 g de sílica GF 254 em um frasco erlenmeyer com tampa, e acrescenta-se cerca de 50 mL de água destilada. Agita-se bem até que a mistura fique homogênea e a consistência adequada para se espalhar nas placas de vidro.

2. Coluna cromatográfica de adsorção

A coluna de vidro é facilmente empacotada adicionando-se gel de sílica, numa proporção de 1:30 (extrato/gel de sílica) ou dependendo do caso até 1:100, com o solvente previamente selecionado por CCD, e passando várias vezes o solvente para melhor empacotamento da sílica. O extrato é adicionado ao topo da coluna, dissolvido em solvente adequado ou adsorvido em pequena quantidade de gel de sílica (na forma de pastilha), e os componente são eluídos.

3. Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE ou HPLC)

É utilizada para compostos de alto alto peso molecular e pouco voláteis, bem como materiais termicamente instáveis. HPLC é uma técnica rápida, comparada ao método clássico de cromatografia em camada (fina ou preparativa), e permite análises quantitativas além de poder ser automatizada, dando alta produtividade. A maior desvantagem desta técnica é o alto custo do equipamento.

Identificação por métodos espectroscópicos e espectrometria

Será realizada através da obtenção e análise dos espectros de ressonância magnética nuclear (RMN de 1 H e de 13 C), de ultravioleta (UV) e de infravermelho (IV) e de espetrometria de massas (EM - que dá o peso molecular de cada componente químico).