PRINCÍPIO DO MÉTODO RAPD (Random Amplified Polymorfic DNA)

A técnica do RAPD faz uso da tecnologia da PCR. Pela técnica da PCR, dois oligonucleotídios específicos (geralmente de 18 a 25 pb de comprimento), complementares a seqüências que circundam o segmento alvo, são sintetizados para servir como "primer" para a reação de amplificação do DNA. Ao contrário, pelo RAPD um único "primer" de curto comprimento (9 ou 10 bases) de sequência arbitrária e uma temperatura de anelamento mais baixa do que a média usada na reação de PCR são empregadas. Estas duas modificações diminuem a especificidade da reação de forma que um número maior de fragmentos reproduzíveis possa ser amplificados por eletroforese em gel de agarose, e a coloração é feita com brometo de etídio, de forma que torna-se desnecessário a utilização de isótopos radioativos que normalmente são usados na técnica de RFLP. As mutações que inibem a ligação do "primer", ou por outro lado, interferem na amplificação podem ser detectadas pela ausência da banda pertinente nestes indivíduos (Bowditch et al., 1991).

Devido aos curtos oligonucleotídeos servirem como "primer" para uma variedade de genomas nas condições especificadas, é possível se desenvolver um painel de "primers" universais que podem ser utilizados para detectar polimorfismos de forma direta em praticamente qualquer ser vivo usando-se panas nanogramas de DNA molde (Bolwiditch et al., 1991). Para se realizar um ensaio de RAPD, oligonucleotídio de DNA de fita simples, de seqüência arbitrária é misturado com DNA genômico em presença de dNTP's (dinucleotídios monofosfatados) , de uma DNA polimerase termoestável e um tampão adequado, e este é então sujeito a variações cíclicas de temperatura, típica de PCR. Os produtos de reação dependem da seqüência e comprimento do oligonucleotídio, assim como das condições de reação. Numa temperatura de anelamento apropriada durante a ciclagem térmica, o "primer" de fita simples liga-se a sítios em fitas opostas do DNA genômico que estão dentro de uma distância amplificável (isto é, dentro de alguns milhares de nuclotídios), e um segmento discreto de DNA é amplificado.

A presença ou ausência deste produto específico, embora amplificado com um "primer" arbitrário, será diagnóstico para os sítios de ligação do oligonucleotídio no DNA genômico. Na prática, considerando-se o objetivo pretendido, a reação de amplificação do DNA é repetida num grupo de amostras de DNA com muitos "primers" diferentes, em condições que resultam em muitas bandas amplificadas para cada "primer". As bandas polimórficas são notadas, por exemplo, entre pais de um cruzamento, e os polimorfismos podem ser mapeados numa população segregante. Freqüentemente, um único "primer" pode ser usado para identificar vários polimorfismos, cada um referente a um diferente locus (Williams et al., 1993).