Extração de DNA

As bactérias serão crescidas em 100ml de CN, sob agitação (200 RPM) por 18 horas (over night). Em seguida, centrifuga-se a cultura de bactérias por 5' a 6000 RPM (4303g), em tubos e despreza-se o sobrenadante. Ressuspende-se o pelet em 4ml de TEN, contendo lisozima (4mg/ml) e incuba-se por 30-45 minutos a 37^oC. Adiciona-se então, 8ml de RNAse (25mg/ml) e incuba-se por 15' em temperatura ambiente. Acrescenta-se 580ml de SDS e incuba-se a 750C até a solução se tornar clara. Acrescenta-se, em seguida 2.5ml de acetato de sódio (3M; pH5,2), e incuba-se por 20' em gelo, e logo em seguida acrescenta-se um volume de clorofane e agita-se o tubo, suavemente por inversão. Centrifuga-se a 4000 RPM (1912g) por 15'. Após esta centrifugação, retira-se o sobrenadante e acrescenta-se um volume de clorofil, agita-se o tubo suavemente por inversão e centrifugou-se a 4000 RPM (1912g) por 15'. Retira-se o sobrenadante e repita-se o processo com clorofil. Por último, retira-se o sobrenadante e acrescenta-se dois volumes de etanol gelado e espera-se a precipitação do material, este processo foi realizado a -200C (over-night). Após a precipitação, centrifuga-se a 12.000 RPM (17.210g) por 20', elimina-se o secagem dos tubos a temperatura ambiente, o DNA foi solubilizado em 500ml de Etanol.