ANÁLISE DA BIODIVERSIDADE CROMOSSÔMICA DE FUNGOS E ACTINOMICETOS

A maioria dos protocolos para determinação cariotípica têm sido desenvolvidos empiricamente. Para fungos, os passos em geral, são:

a) obter os protoplastos;
b) suspender os protoplastos em 1,4% de agarose fundente (42°C);
c) incubar a 50°C por uma noite pequenos géis de agarose contendo os protoplastos, com uma solução de proteínase K para dissolver a membrana do protoplasto e liberar o conteúdo nuclear;
d) lavar os géis com EDTA. Esses podem ser preservados, por até 4 meses a 4°C antes do uso;
e) colocaçào dos pequenos géis no gel para corrida na cuba de eletroforese. Usar gel com 1,5% de agarose,
f) após corrida eletroforética que deve durar 18-20 horas, os géis devem ser visualizados sob luz ultravioleta, depois de corados com brometo de etídio (0,5 mg/ml).

Diferentes voltagens a tempo de corrida devem ser tentadas para diferentes organismos. Em geral, utilizam-se temperaturas de 4 a 16°C com alta voltagem (260 - 300 V) e corrente em torno de 130 mA a 200 mA. Alguns experimentos para visualização do DNA durante a corrida eletroforética têm sido propostos. Para isso, a corrida foi feita em uma câmara sobre uma plataforma de um microscópio de epifluorescência. As moléculas de DNA marcadas podem ser vistas estendendo-se e enrolando-se e se orientando novamente à medida que o campo elétrico muda de direção. Smith et al. (1990) têm usado simulações de computador que usam modelos matemáticos de moléculas de DNA para reproduzirem os movimentos do DNA no gel.