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Amplificação
do DNA (Reação de PCR)
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Após a realização de um ensaio de otimização da
técnica (Williams et al., 1990) são estabelecidas as seguintes
condições de amplificação:
PCR Buffer 10 x (GIBCO-BRL) 2,5mL (1x)
Solução de Cloreto de Magnésio 2,5ml (5,0M)
dNTP's (2,5mM) 2,0ml (200uM)
oligonucleotídio (4,0mM) 2,5ml (0,4mM)
DNA genômico 2,5ml (5,0ng)
Taq-DNA polimerase 0,3ml (2,0U)
Água Mili-Q autoclavada 12,7ml
O termociclador utilizado para a reação será o da Perkin-Elmer-Cetus
(Gene Amp PCR System), iniciada por denaturação por 4 minutos
a 92oC, seguida de 40 ciclos de 1 minuto cada a 92oC,
1 minuto e 30 segundos a 37oC e 2 minutos a 72oC.
A seqüência e conteúdo de bases CG dos oligonucleotídios utilizados
irá variar, dependendo dos kits do operon.
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