Amostragem e Isolamento

Amostras de plantas sadias serão coletadas em diferentes regiões geográficas e climáticas localizadas no estado de São Paulo. O Estado será mapeado obedecendo ao cultivo das diferentes espécies agrícolas eleitas (café, soja, citros, mandioca. ..). Quando necessário, no caso de comparações fitogenéticas, serão coletadas amostras de plantas de cultivares ou populações mantidas por agricultores e/ou indígenas por longo tempo. Uma estatégica de escolha de espécies botânicas foi seguida levando-se em consideração que muitas são nativas do Brasil e América Latina e importancia econômica e, considerando-se, co-evolução de microrganismos associados com essas espécies, a associação simbiótica de fungos e bactérias e a proteção fitossanitária que muitos desses microrganismos fornecem à planta. De todas as espécies botânicas em estudo serão isoladas fungos, bactérias e actinomicetos a partir de raízes, ramos e folhas. Uma pré-lavagem vigorosa das amostras será necessária para reduzir o número da microflora epífita. O material selecionado para isolamento deverá ser removido da planta, quando possível, imediatamente antes por agitação vigorosa em um "shaker"ou em uma solução de chloramine T 1% por 30 min. ou hipoclorito de sódio 5,25% contendo 0,01% de Tween 20 ou Triton X-100 0,05% por 50min. A solução de esterilização é removida e o material vegetal é enxaguado três vezes (3min. cada vez) em água destilada esterilizada. Antes do material ser plaqueado em meios seletivos os segmentos de tecidos devem ser cortados novamente, com 1/8 a 1/3 de comprimento. Os fragmentos são colocados em meios específicos para isolamento de fungos, bacterias e octinomicetos. O meio de cultura inicial será aquele é ou semiseletivo para taxa específicos ou manufaturado para isolamento geral de fungos e bactérias. As temperaturas de incubação serão aquelas ideais para as respectivas plantas hospedeiras. E o tempo de incubação para fungos e octinomicetos em geral, variará de 3 a 8 semanas. Para isolamento de bactérias, o tempo incubação varia e é dependente do meio, mas 24 a 72 horas é comum. Imediatamente à lavagem dos segmentos radiculares para retirada de de agregados do solo(em água destilada esterilizada), elas devem ser imersas numa solução tampão fosfato (pH 7.0) por 10min., para equilibrar a pressão osmótica e evitar difusão passiva de agentes esterilizantes nas raízes.